关于积分，外部的关注点主要是合规性。而作为具体岗位色谱分析师或分析方法研究人员，显然，只关注合规性是不足的。那么，从头扒一扒，梳理一下自己的知识，以期提高。      

       色谱学里面主要用到保留时间、峰面积、峰高来识别、判定成分的类别、含量、纯度等。峰高、峰谷和保留时间这三个问题很好解决，看时间-峰值切片对应拐点-斜率变化就可以了，除非阈值选值有问题或者GPC领域，一般没有5变化。那么，峰面积就成了最后一个需要解决的问题了，这也是合规性或者研究数据科学性需要重点考虑的。      

       峰面积是积分的结果，而积分就是无限微分后的无限积分（俗话就是切片面积和）。然后通过与对照品峰面积比、自身峰面积占比等数据处理方式进行校准、计算；而对于GPC领域，要用到的是保留时间与分子量对数的函数以及切片的重均、数均、Z均分子量分布等信息。也就是说，峰面积准不准是色谱学中最终数据可报告性的决定性因素。当然，并不是说一味的按照处理向导使用默认参数处理色谱峰就能获得科学可靠的结果。既然有积分参数，那么就需要根据方法特征进行研究、固化、调整。

正向思维，哪些因素与色谱峰面积有关呢?当你在上帝视角的时候，你能做些什么呢？

 

① 第一屏，可见的几个参数有峰宽、阈值、最小峰面积、最小高度

      这一屏就可能存在多个上帝之手。峰宽、阈值这两项一般经过柱筛选、分离参数优化、峰纯度检测等一系列方法研究，已经能够可以固化，除非当遇到特殊保留行为时才需要调整。

因为峰宽、阈值又与系统适用性中某些参数直接相关，所以要解释一下：

峰宽：在峰的两侧拐点做切线和峰底相交两点间的距离。“传统”积分使用峰宽值来计算数据分组因子。峰检测期间，通过用“峰宽”与（采集数据时的）采样率的整数乘积除以 15 来确定用以在色谱中产生单个点的组合点数。 

阈值：“传统”积分使用阈值参数（微伏/秒）来为峰检测指定峰起点和峰终点值（检测器信号的最小变化率）。软件会计算三组数据点上的斜率变化，然后将这一变化与“阈值”参数进行比较。当计算出的斜率变化超过阈值时，即会发生峰起落。

 一句话：峰宽和峰是否苗条有关，阈值和你有多少个峰有关。

      另外就是最小峰面积和最小高度这两项。如果被设置，就意味着峰/无效峰的剔除。如果对于杂质测定，设置这两项显然要谨慎，至少要和空白和标样重叠对比，用空白进行确认。否则手一抖、杂质就没了。

 

② “处理参数”这一屏，用于设置具体的积分参数。也是合规性审计中的隐身项。当然这些参数在合规设置使用的情况下，能够提高效率。

1、传统计分方法和ApexTrack积分方法（后者据说为waters打标TM的方法）。

      传统积分方法可以设置的参数有峰宽、阈值、最小峰面积、最小高度。ApexTrack积分有顶点检测（开始、结束、峰宽、检测阈值）和峰积分（峰起点%、最小面积、最小高度）两栏参数。从原理上说：色谱峰积分包括三个步骤：峰检测、基线位置以及峰面积、峰高和保留时间的确定。那么检测过程应该和方法验证时使用相同的积分方法，这也考验方法转移、方法确认时应注意考虑足够多的详细信息。

传统积分执行下列功能：

A.自动为色谱确定适当的峰宽值和阈值，除非已在处理方法中设置。

限制：如果启用了“使用 V3.0x 的峰宽和阈值确定方法”系统策略，Empower 将无法自动确定峰宽和阈值。 

B.检测色谱中的峰开始和结束点 。 

C.积分峰以确定其保留时间、面积和高度  

ApexTrack 积分：

       方法检测峰和定位基线的方法与传统积分方法的不同之处主要体现在以下几个方面：      

       ApexTrack 积分使用色谱的二阶导数检测峰。[传统积分使用斜率阈值（一阶导数）检测峰。] 峰检测参数独立于基线位置参数。[对于传统积分则不是这样。] 搜索算法从每个峰的顶点开始，向下向外计算，画出基线。当展开的基线相遇并融合时，簇即被确定。 

ApexTrack 积分提供肩峰检测、改进的负峰检测和积分以及高斯切削。      

另外，对于ApexTrack 积分，手动积分时，某些【作死动作】并不被ApexTrack 积分原则“顺从”：

       为了能够在 ApexTrack 积分中扩展峰或簇时添加更多峰，Empower 软件会在 ApexTrack 手动积分期间忽略某些处理方法参数和事件。

     这些参数和事件是：“开始”、“停止”、“最小高度”、“最小面积”、“禁止积分”、“设置最小高度”、“设置最小面积”、“设置最大高度”和“设置最大宽度”。

 

积分事件：一种基于时间的操作，用于定义色谱中的峰检测和/或峰积分（如峰开始和结束、基线开始和结束等）。积分事件在处理方法中指定。

示例软件支持 18 种基于时间的事件。当缺省的峰检测和积分参数不足以检测和积分色谱中的所有峰时，可以应用多个事件。

当然这些行为主要用在方法研究阶段。

以下是各个事件的的雷区和效率工作方式，菜刀没错，就看你用刀干什么，阿弥陀佛！

1 允许负峰

      这个事件主要出现在方法研究阶段，比如未识别离子色谱极性时，峰为负值，或者IR设定了错误的仪器方法，又不想废弃这个序列的研究结果，也可能峰位于梯度洗脱的波谷区。当然正式的检验方法较少出现这种情况。

2指数曲线切削及切线切削

      通过绘制一条直线从父峰中指数曲线切削驼峰，可从父峰分离驼峰。切削（前或后）取决于用户指定的开始和停止事件时间窗口以及用户指定的高度比率。如果“指数曲线切削”事件在融合峰簇之外开始和结束，则最高的峰被选为父峰。此父峰发生前切削或是后切削取决于输入值的符号。如果值小于 0，软件将尝试前切削。如果值大于等于 0，软件将尝试后切削。 

通常这个参数使用不多，毕竟最好的方式是至少基线分离。

具体见图1（图我放在课件里面了，帮助菜单都有原图，可自行提取）

 

 

3 强迫垂线

       通过在指定的事件时间窗口中插入一条垂线来控制峰积分。如果启用“强迫垂线”，软件会先不考虑事件时间窗口来计算基线，然后再根据事件时间窗口重置单峰或融合峰的峰开始和结束时间。“强迫垂线”事件可与以下事件一并使用： 

A“强迫峰”事件中的一个或多个“强迫垂线”事件； 

B“切线切削”或“指数曲线切削”事件。 

     “切线切削”和“指数曲线切削”事件可能需要在父峰内使用“强迫垂线”，尤其当父峰为“受强迫峰”时。为获得最佳结果，请对要被切削的每个峰只添加一条垂线。要切削包含在父峰中的峰时，需要使用此事件。可使用“强迫垂线”事件从父峰创建一个独立的峰，然后使用“切线切削”或“指数曲线切削”事件。 

乖乖操作，合理使用，禁止上帝之手。 

具体见图2（图我放在课件里面了，帮助菜单都有原图，可自行提取。（后面就不放图了，编辑太麻烦）。

 

 

按峰和时间强迫基线定时事件

基于下述内容之一绘制基线：

A事件开始和结束时间（“按时间强迫基线”无指定值） 

B开始和结束时间处的色谱信号平均值（“按时间强迫基线”有指定值） 

C峰开始和结束点（按峰强迫基线） 

使用“按时间强迫基线”或“按峰强迫基线”注意事项： 

A使用没有指定值的“按时间强迫基线”时，基线从事件开始处的信号值延伸到事件结束处的信号值。根据强迫基线调整峰面积和高度。 

B使用有指定值（在“积分事件”表的“值”列中指定）的“按时间强迫基线”时，软件会将开始时间（加上或减去指定的时间窗口值）和结束时间（加上或减去指定的时间窗口值）定义的区域的色谱信号进行平均。然后，通过使用开始时间和其平均基线值及结束时间和其平均基线值指示的点计算峰基线。根据强迫基线调整峰面积和高度。  

C使用“按峰强迫基线”时，基线在指定的时间间隔内从第一个检测到的峰开始点延伸到最后一个峰的结束点。根据强迫基线调整峰面积和高度。 

提示： 

A强迫基线不必是水平基线。  

B某些事件与“按时间强迫基线”或“按峰强迫基线”事件不兼容。  

C如果任一“强迫基线”事件处于活动状态时在色谱中出现负峰，则会发生以下响应： 

C1如果“允许负峰”事件关闭，基线会在负峰的任一侧延伸（但不跨过）。负峰不会被积分。  

C2如果“允许负峰”事件打开，基线会跨过积分的负峰延伸。积分的负峰会被添加到峰列表中。 

应用：

      取消由于梯度方法引起的基线上升时，可能会应用这些事件。还可将其与“允许负峰”配合使用，积分其后紧随负峰的正峰（两峰间无基线）。

这个我没用过，不举例了。

6强迫峰

      通过在事件时间窗口中定义峰控制峰积分。启用“强迫峰”时，软件将时间窗口作为新的峰开始和结束点，并在这两点间绘制新基线。与“强迫垂线”事件不同，“强迫峰”事件始终强迫峰，即使通常情况下不存在未使用该事件积分的峰。重叠“强迫峰”事件创建的峰的任何峰都将被删除。 

应用： 

A不考虑色谱形状，添加一个在特定时间开始和结束的峰  

B积分在其它情况下难以检测到的（大峰周围的）小峰

7按峰正向水平

基于峰开始点正向（向右，随时间增加）绘制一条斜率为零的水平基线。 

在“正向水平”事件的开始点处，软件从指定的事件开始时间或峰开始点向右强迫水平基线。根据水平基线调整峰面积和高度。 

      使用“按峰正向水平”时，基线从事件开始后第一个检测到的峰的开始点处的信号值水平延伸，并会影响事件时间窗口内的所有峰。 

如果缺省积分产生一系列部分分离的峰，则可能会应用到这些事件。使用“按时间正向水平”或“按峰正向水平”事件在每个峰上生成一条垂线，以便获得更准确的峰积分。 

具体见图3

 

 

       禁止积分禁止在用户指定的开始和结束时间窗口内积分峰，从“禁止积分”的开始点一直到“禁止积分”结束时间的数据点之间，都不进行峰积分。时间窗口内的所有数据都将被忽略。在以下情况下可能要应用此事件：清除色谱中的早期洗脱液空体积峰；清除最后一个感兴趣峰之后的噪音峰。这个应用可以使色谱图看着清爽，但是也是上帝之手的重灾区。

具体见图4

 

 

      按峰反向水平基于峰结束点向后（向左，随时间减小）绘制一条斜率为零的水平基线。在“反向水平”的结束点处，软件向左强迫水平基线到指定的峰开始点。软件根据水平基线调整峰面积和高度。使用“按峰反向水平”时，基线从事件内最后一个检测到的峰的结束点处信号值水平延伸，并会影响事件时间窗口内的所有峰。应用如果缺省积分产生一系列部分分离的峰，则可能会应用到这些事件。使用“按时间反向水平”或“按峰反向水平”事件在每个峰上生成一条垂线，以便获得更准确的峰积分。

具体见图5 

 

 

按时间反向水平定时事件基于下述内容之一反向（向左，随时间减小）绘制一条斜率为零的水平基线：

A事件结束时间（“按时间反向水平”无指定值） 

B结束时间处的色谱信号平均值（“按时间反向水平”有指定值） 在“反向水平”的结束点处，软件向左强迫水平基线到指定的事件开始时间。软件根据水平基线调整峰面积和高度。应用如果缺省积分产生一系列部分分离的峰，则可能会应用到这些事件。使用“按时间反向水平”或“按峰反向水平”事件在每个峰上生成一条垂线，以便获得更准确的峰积分。

具体见图6和图7 

 

十一和十二、设置峰起点和峰重点重新定义基线斜率要与之比较以确定峰开始的值（峰起点阈值）。此值在指定下一“设置峰起点”事件前处于活动状态。类似的还有设置峰终点。不说了，收起你那急不可耐的一双手。

具体见图8、

 

 

设置最大高度和最小高度这个都好理解，就不啰嗦了。

最大宽度（秒）“设置最大宽度”事件定义希望软件将其包含到峰列表中的积分峰的最大峰宽。、

       事件过程中，软件将舍弃“宽度”值大于事件值的峰。与“设置最小高度”和“设置最小面积”事件一样，“设置最大宽度”事件影响事件开始时所在的峰（如果有）和事件开始后的所有峰，除非其它带有更晚开始时间的“设置最大宽度”事件代替了它。 

       设置最小面积此事件设置按最大 3 位精度定义软件报告的最小峰面积（单位为：微伏·秒）。

       峰结果中不显示任何面积小于此处指定面积的峰。优化色谱的感兴趣的峰的积分后，请使用此参数剔除不需要的峰。提示：在此后的运行期间或指定另一“设置最小面积”事件前，新设置会覆盖全局指定的“最小面积”参数。不说了，收手吧。

具体见图9

 

 

       设置峰宽（秒）传统”积分和 ApexTrack 积分定义峰宽的方式不同。更改峰检测期间所使用的峰宽。在下一“设定峰宽”事件或运行结束前，此值一直处于活动状态。提示：要使“设置峰宽”处于活动状态，必须在检测到的单峰或融合峰开始前的适当时间将其激活。此事件会在此后的运行中（或遇到另一个“设置峰宽事件”前）覆盖全局“峰宽”检测参数。使用“传统”积分示例在本示例中，峰宽设置为 60，采样率设置为 1，检测算法将为包含四个原始数据点的每个组生成分组数据点。此设置将峰内分组数优化为 15。

具体见图10 

 

       峰谷到峰谷峰谷到峰谷定时事件可使用“传统”积分和 ApexTrack 积分，但各自的执行方式不同。使用传统积分的指导原则此定时事件可设置融合峰中每个峰的开始和结束点处的基线（在用户指定的开始和停止时间窗口内）。如果不使用此事件，系统会为所有融合峰绘制共用基线，各峰间用垂线分隔。启用时，“峰谷到峰谷”事件在每个峰的开始和结束点重新指定基线。所有峰均成为基线分离峰，并在“峰”表（“查看主窗口”和“结果”窗口）中被标记为 BB。被激活的“峰谷到峰谷”始于事件开始时间后检测到的第一个峰，止于事件停止时间前检测到的最后一个峰。限制：“峰谷到峰谷”事件不能与“按峰正向水平”、“按时间正向水平”、“按峰反向水平”、“按时间反向水平”、“按峰强迫基线”、“按时间强迫基线”、“切线切削”、“指数曲线切削”事件或另一个“峰谷到峰谷”事件交迭，但可以与所有其它事件交迭而不发生冲突。应用在以下情况下可能要应用此事件：A缺省积分将单个峰当作一个融合峰，而用户实际上认为真正的基线位于各个峰的开始和结束点处。B变化基线（由梯度方法引起）使一个（或多个）峰生成于基线上升之上。

具体见图11